Антинуклеарный фактор (АНФ, HEp-2) с определением типа свечения (в крови)

Общие сведения

Антинуклеарные антитела (АНА,ANA, антиядерные антитела, антинуклеарный фактор-АНФ)- метод НИФ на линии клеток HEp-2 с определением тип свечения. - показатель аутоиммунных заболеваний соединительной ткани. АНА представляет собой группу аутоантител к белкам и другим компонентам (включая ДНК), находящимся в ядрах клеток. Основные показания к применению: исключение диагноза - системная красная волчанка (считается, что АНА появляются в 90% случаев СКВ, иными словами, отрицательный результат с вероятностью около 90% исключает диагноз СКВ), дифференциальная диагностика системных коллагенозов (системная красная волчанка, склеродермия, узелковый периартериит, дерматомиозит), хронический активный гепатит.

К настоящему времени описано более 200 разновидностей АНА, направленных против нуклеиновых кислот, гистонов, белков ядерной мембраны, компонентов сплайсосомы, рибонуклеоротеинов, белков ядрышек и центромер. При этом они повреждают соединительную ткань, что и способствовало внедрению определения антинуклеарного фактора в качестве теста на системные заболевания соединительной ткани. Под термином «антинуклеарный фактор» понимают тест для выявления антинуклеарных антител с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции.

Одним из способов выявления антинуклеарного фактора в крови (антинуклеарных антител) является метод непрямой иммунофлюоресценции путем нанесения сыворотки пациента на клетки тканей перевиваемой линии человеческих клеток HEp-2 (клетки эпителиальной карциномы гортани человека линии Hep-2, содержащие различные ядерные антигены), используя меченый конъюгат с человеческими антителами. В качестве субстратов могут применяться и другие человеческие клеточные линии, однако благодаря хорошей морфологии и удобству культивирования именно линий Нер-2 стала общепризнанным субстратом непрямой иммунофлюоресценции. Метод обнаружения АНФ был разработан Tan в 1982, применившим в качестве субстрата человеческую перевиваемую эпителиоидную клеточную линию HEp-2. Это клеточная линия, полученная из аденокарциномы гортани человека, представляет собой крупные полиплоидные неороговевающие плоские эпителиоциты, образующие монослой на стекле. Сыворотку больного инкубируются с тканевым субстратом, при этом антинуклеарные антитела из сыворотки больного (если они присутствуют) связываются с соответствующими ядерным антигенами. Места связывания аутоантител детектируются с помощью античеловеческой антисыворотки, меченной флюоресцеином. Результаты реакции оцениваются микроскопией с помощью люминисцентного микроскопа и визуальной оценки характера свечения связавшихся антител. Среди преимуществ HEp-2 (при сравнении с криосрезами тканей животных) можно отметить высокую частоту деления клеток, позволяющую выявлять антитела к антигенам, экспрессирующимся только при делении клетки, и отсутствие клеточного матрикса ткани, затрудняющего визуализацию специфического свечения при сравнении с гистологическими срезами. При некоторых заболеваниях, например СКВ, системной склеродермии (системный склероз), некоторых инфекциях, иммунная система пациентов воспринимает ядра (белки ядер) клеток собственных тканей, как чужие, и продуцирует к ним антитела (антинуклеарные антитела - AHA). При этом они повреждают соединительную ткань, что и способствовало внедрению определения антинуклеарного фактора в качестве теста на системные заболевания соединительной ткани.

При интерпретации данных следует учитывать, что спектр AHA включает в себя большую группу аутоантител к ДНК, нуклеопротеидам, гистонам, ядерным рибонуклеопротеидам и другим компонентам ядра. Таким образом, тест направлен на обнаружение различных антител к компонентам ядра и цитоплазмы, которые впервые были обнаружены при СКВ. В дальнейшем диагностические критерии теста были расширены в связи с обнаружением данных антител и при других заболевания соединительной ткани.

В скрининговых тестах для определения суммарных АНА обычно используется набор следующих антигенов, являющихся основными маркерами аутоиммунных заболеваний соединительной ткани: SS-A (Ro), SS-B (La), BNP70, Sm, RNP/Sm, J01, центромере B.
Основные антигены, применяющиеся в современных наборах для выявления ядерных антител класса IgG представлены следующим набором:

  1. SS-A (Ro) - ядерные рибонуклеопротеины, (полипептиды). Антитела на них обнаруживаются, чаще, при системной склеродермии (60 % случаев), синдроме Шегрена (до 70% случаев) и при СКВ (до 30% случаев). Считается, что если данные антитела обнаруживаются в крови у беременных, то это является показателем риска увеличения возникновения неонатального волчаночноподобного синдрома у новорожденного ребенка (неонатальный люпус-синдром). Данные антитела матери проходят через плаценту и вызывают поражение плода, приводящие к гемолитической анемии и тромбоцитопении. К тяжелым последствиям относят поражение проводящей системы сердца ребенка (вплоть до постоянной кардиостимуляции). Отмечено, что у женщин у которых во время беременности был выявлен значительный титр данных антител, без явных клинических признаков, в дальнейшем развивается какое либо аутоиммунное заболевание, включая СКВ.
  2. SS-B (La) - ядерные белки. Антитела к ним выявляются до 60% случаев при синдроме Шегрена и в 15% случаев при СКВ.
  3. Scl-70 - белок-фермент, участвующий в обмене нуклеиновых кислот (топоизомераза-1). Антитела на данный белок наиболее специфичны при системной склеродермии (до 70% случаев).
  4. Двухцепочечная ДНК - нативная ДНК. Антитела к ДНК наиболее специфичны при СКВ (до 80% случаев) и практически не определяются при ревматоидном артрите и склеродермии.
  5. RNP/Sm - Комплекс антигенов RNP/Sm состоит из U1-рибонуклеопротеидов: U1-68, U1-A, U1-C, U5, U6; а также из Sm-полипептидов: SmA | , SmB | B, SmD, SmE, SmF, SmG. Антитела, образующиеся к этим антигенам наиболее специфичны для смешанных заболеваний соединительной ткани - т.е. при наличии симптомов склеродермии, ревматоидного артрита, СКВ, полимиозита (около 95% случаев) и в меньшей степени для СКВ (до 30% случаев).
  6. Jo-1 - фермент - синтетаза аминоацилтранспортной РНК. Аутоантитела к данному белку являются диагностически значимыми при миозите (полимиозит/дерматомиозит).
  7. CENP-B (Центромера) - для выявления Антицетромерных антител (Anti-Centromer B), с целью диагностики CREST-синдрома (данный синдром представляет собой совокупность кальциноза кожи, синдрома Рейно, нарушения моторики пищевода, склеродактилии, телеангиэктазии). CREST-синдром относится к варианту системной склеродермии (системный склероз). Данные антитела у больных свидетельствуют о благоприятном течении системной склеродермии и говорят о небольшом поражении внутренних органов.
  8. Hep-2 клетки - клетки эпителиальной карциномы гортани человека линии Hep-2, содержащие много различных ядерных антигенов, включая антиген SS-A (Ro) и антигены центромеры. Антитела к Hep-2 обнаруживаются у больных с полимиозитом и дерматомиозитом до 90% случаев.
  9. Митохондрии (PDC) - PDC - пируватдегидрогеназный комплекс. Большая группа антимитохондриальных антител представляют собой аутоантитела, которые образовались на ферменты пируватдегидрогеназного комплекса, располагающегося в митохондриях клеток и участвующего в окислительном декарбоксилировании пирувата.

Часто АНА обнаруживаются при билиарном циррозе печени.

AHA обычно не проникают в живые клетки и поэтому безвредны. Но иногда они образуют комплексы антиген-антитело, которые вызывают повреждение ткани (как, например, при СКВ поражение почек). В связи с вовлечением в патологический процесс многих органов диагностическое значение определения AHA невелико и результаты анализа лишь частично подтверждают клинические данные.

Помимо ревматических заболеваний, АНА обнаруживаются и при хроническом активном гепатите до 50% случаев. Появление (низкие титры) возможно при воспалительных заболеваниях, онкологии и вирусных инфекциях.

  • Сравнительная частота выявления антинуклеарных антител.
    Заболевание и состояние Частота выявления, %
    СКВ
    95-100
    Люпоидный гепатит (новое название - хронический аутоиммунный гепатит)
    70 -80%
    Синдром Фелти (Felty. 1924 г.) - ревматоидный артрит + спленомегалия + нейтропения + лейкопения + лимфоаденопатия.
    95-100
    Системная склеродермия
    75-80
    Лекарственный волчаночныи синдром (гидралазин, прокаинамид, изониазид)
    Около 50
    Синдром Шегрена (Аутоиммунное системное поражение соединительной ткани. Характеризуется вовлечением в патологический процесс желез внешней секреции, главным образом слюнных и слезных, и хроническим прогрессирующим течением ).
    40-75
    Клинически здоровые родственники пациента с СКВ
    Около 25
    Дискоидная красная волчанка
    15-50
    Хронический ювенильный артрит, ревматоидный артрит
    15-30
    Узелковый периартериит
    15-25
    Дерматомиозит и полимиозит
    10-30
    Ревматизм
    Около 5
    Синдром Рейно
    15-20

     
 

Вернуться к оглавлению

Процедуры

  • После венепункции набирают кровь в пустую пробирку или с разделительным гелем.
  • Место венепункции придавливают ватным шариком до остановки кровотечения.
  • При образовании гематомы в месте венепункции назначают согревающие компрессы.
 

Вернуться к оглавлению

Референтные значения

Титр менее 1:160
 

Вернуться к оглавлению

Цель исследования

Дифференциальная диагностика системных/ревматоидных заболеваний.
 

Вернуться к оглавлению

Отклонения от нормы

Отрицательный результат с вероятностью до 90% исключает диагноз - системная красная волчанка (СКВ), а также синдром Шегрена, диффузную склеродермию, вторичный антифосфолиподный синдром, смешанное заболевание соединительной ткани, CREST-синдром, олигоартикулярную форму ювенильного ревматоидного артрита. С вероятностью до 80% отсутствие АНФ исключает аутоиммунный гепатит 1 типа, первичный билиарный цирроз.
Следует учитывать, что антинуклеарный фактор может быть отрицательным у единичных больных с СКВ, антифосфолипидным синдромом, полимиозитом. В этих случаях необходимы дополнительные обследования.

По характеру флюоресценции ядер (люминисцентная микроскопия в реакции НИФ - непрямой иммунофлуоресценции) можно установить природу иммунного заболевания. Использование клеток линии НЕр-2 позволяет охарактеризовать более 20 различных вариантов окрашивания ядра, которые зависят от спектра антител, присутствующих в исследуемой сыворотке ( гомогенный, крупногранулярный, мелкогранулярный, митохондриальный, перефирический, точки в ядре, центромерный, цитоплазматический, ядрышковый). Периферическая (разновидность гомогенного сечения) флюоресценция характерна для СКВ, так как свидетельствует о присутствии анти-ДНК-антител. К основным антигенам при этом типе свечения являются - ДНК и гистоновые белки. Гомогенная, или диффузная, флюоресценция также характерна для СКВ с поражением почек, и сходных с ней заболеваний соединительной ткани, нефрите, лекарственно-индуцированной СКВ, системных и локализованных формах склеродермии. Антигенами при диффузном типе являются - нуклеосомы, дсДНК и гистонаны. Флюоресценция нуклеол (ядрышковое) наблюдается при системной склеродермии. Ядрышковый тип флюоресценции определяется у больных при наличии антител к компонентам ядрышка - PHК полимераза 1, NOR, U3RNP, PM/Scl. Цитоплазматический тип свечения указывает на антитела к тРНК–синтетазам, в частности Jo-1, и характерен при полимиозите. Гранулярный (крапчатый,пятнистый) характер флюоресценции отмечается при инфекционном мононуклеозе и смешанном заболевании соединительной ткани ((MCTD, Sharp-синдром), синдроме Шегрена, лекарственном волчаночном синдроме. К основным антигенам, антитела к которым приводят к появлению гранулярного типа свечения, относят Sm, U1-RNP, SS-A, SS-B и PCNA. Крупногранулярный тип свечения отмечается при смешанном заболевании соединительной ткани и скорее всего заключается в присутствии RNP антигена. Мелкогранулярный тип (антитела против рибонуклеиновых белков - SS-A, SS-B и др) - при СКВ, кожных формах красной волчанки, склеродермии, синдроме Шегрена, ревматоидном артрите, полимиозите. Центромерный тип встречается при склеродермии. При взятии одной пробы крови, особенно у пациентов с диффузными заболеваниями соединительной ткани, в сыворотке могут обнаруживаться антитела к различным участкам клеточных ядер. Точки в ядре встречаются при аутоиммунных заболеваниях печени. Возможно сочетание нескольких типов свечения, например мелкогранулярного и ядрышкового, что характерно для антител к Scl-70. Кроме того, по мере увеличения разведения сыворотки характер флюоресценции может меняться, так как различные антитела проявляют активность при разных титрах.

 

Вернуться к оглавлению

Вверх